馬鈴薯莖尖超低溫冷凍脫毒方法一般按照選擇材料,、切取莖尖、預培養(yǎng),、預處理,、超低溫冷凍,、解凍、恢復培養(yǎng),、脫毒效果檢測、組織培養(yǎng)擴繁這幾個步驟來獲得再生植株,，經(jīng)過病毒檢測后,，無毒植株用于生產脫毒馬鈴薯種薯(圖2)。液氮罐

 

1. 選擇材料

馬鈴薯不同部位的組織經(jīng)過超低溫冷凍處理后細胞的存活力有明顯差異,。一般細胞體積小細胞質較濃,、液泡少的分生組織細胞會比液泡大的成熟的分化細胞再生能力強、成苗率也高,。研究發(fā)現(xiàn)選擇馬鈴薯莖尖分生組織作為處理對象,，可以提高成苗率，有利于獲得脫毒苗,。

2. 預培養(yǎng)材料

材料通過預培養(yǎng)使得細胞適度脫水,，減少細胞內自由水含量，可以提高細胞的抗冷凍能力,，從而提高成活率,。目前*常用的預培養(yǎng)方式是在培養(yǎng)基中添加一些使細胞脫水的保護性物質，可以選用蔗糖,、二甲基亞砜,、甘露醇等,。在高濃度保護性物質處理之前選用0~5℃的低溫馴化，可以明顯提高成活率,。馬鈴薯莖尖可以切取2~3mm大小,，然后放在0.3mol·L-1高蔗糖濃度的預培養(yǎng)基中預培養(yǎng)一天，光照16h,，光照強度2000lx,。高濃度的蔗糖可增加培養(yǎng)基的滲透壓，使得馬鈴薯莖尖組織的細胞脫水,，從而減少細胞內自由水的含量,。

3. 保護劑處理

常用的抗冷凍保護劑是能夠穿透細胞膜的化合物DMSO和各種糖類物質，通過促進細胞膜對水分的通透性,，降低細胞內水分冰點溫度,，避免胞內外冰晶形成，保護細胞內的核酸,、蛋白質等生物大分子物質,。保護劑的選擇是超低溫處理成功的關鍵因素，好的保護劑應該滿足對細胞毒性小,、易溶于水,、解凍后容易從細胞中清洗掉等要求。目前常用Sakai于1990年創(chuàng)立的按照一定配方合成的多種保護劑復合液,，被稱為植物材料玻璃化溶液(plant vitrification solution,，PVS)。將預培養(yǎng)一天后的馬鈴薯莖尖加載到PVS2溶液中,，其中PVS2液的成分為：MS+30%(W/V)甘油+15%(W/V)乙二醇+15%(W/V)二甲基亞砜(DMSO)+0.4mol·L-1蔗糖,。具體方法是用移液管吸取15μL的PVS2溶液加在0.03mm厚的1.0cm×4.0cm的鋁箔上，然后將預培養(yǎng)后的馬鈴薯莖尖裝載到PVS2液滴中,，室溫25℃下處理20min,，成活率可達90%。

4.液氮冷凍處理

將包裹有馬鈴薯莖尖的鋁箔在液氮中蘸一下,，然后把鋁箔條放入1.5mL離心管中,，再將離心管置于液氮中超低溫處理1h。

5. 解凍洗滌

對超低溫處理后的材料需要馬上進行解凍,，常用的解凍方法有兩種：一是快速解凍法,，適合于大多數(shù)材料，具體做法是將液氮中冷凍1小時后的材料放于25~40℃的水浴鍋中進行解凍1~3min完全融化后取出材料,，避免水浴溫度對細胞的熱傷害以及保護劑對細胞的毒害作用,。另一種是慢速解凍法，適用于經(jīng)過低溫馴化或者經(jīng)過脫水處理的材料，把液氮處理1h后的材料在0℃下慢速解凍30min左右,。解凍后的材料一般都需要立刻洗滌,，為了除去細胞內含的高濃度保護劑，避免對恢復培養(yǎng)的影響,。*常用的洗滌方法是室溫下用含1~2mol·L-1蔗糖濃度的培養(yǎng)基洗滌10min左右,。在無菌超凈工作臺中，將液氮處理1h后的包裹馬鈴薯莖尖鋁箔條從離心管中取出,，然后迅速放入加有1.2mol·L-1蔗糖濃度的液體MS培養(yǎng)基中洗滌2~3次,，每次10min。液氮罐

6. 恢復培養(yǎng)

經(jīng)過洗滌后的材料需要立即轉移到恢復培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),。研究發(fā)現(xiàn)將材料先培養(yǎng)在黑暗或弱光下一段時間后,，再在正常光照下有利于形成再生植株。

將洗滌后的馬鈴薯莖尖在無菌超凈工作臺中取出,，用無菌紙吸去殘留在材料表面的洗滌培養(yǎng)基,，接種到固體恢復培養(yǎng)基(MS+0.1mg·L-1NAA+0.5mg·L-16-BA+1.0mg·L-1GA3)上進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件選擇先黑暗培養(yǎng)7d,，再在弱光1000lx下培養(yǎng)7d,，然后正常光照2000lx培養(yǎng)。當分化出根芽后轉移到MS培養(yǎng)基上,，1個月就可獲得完整植株,，統(tǒng)計成活率。

7. 病毒檢測

對再生馬鈴薯試管苗用酶聯(lián)免疫法進行病毒檢測,，只有不帶病毒的組培苗才可以進行組織培養(yǎng)擴繁,，用于生產無毒馬鈴薯種薯。液氮罐