豬胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)自我更新和分化潛能，利用不同培養(yǎng)條件,，從孤雌胚胎,、細(xì)胞核移植胚胎和體內(nèi)受精胚胎中分離樣細(xì)胞。

1.細(xì)胞培養(yǎng)用于核移植供體的豬胎兒成纖維細(xì)胞

從初生豬仔的耳部分離得到,。細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM，15%胎牛血清，培養(yǎng)溫度為37℃,，5%CO2。細(xì)胞凍存,，使用0.25%(W/V)的胰蛋白酶消化,，中和后離心200Xg，5min,。將細(xì)胞重懸后并加入等量?jī)龃嬉?40%DMEM,，40%FBS和20%DMSO)，貯存在液氮罐中,。液氮罐價(jià)格

2.卵母細(xì)胞的收集和準(zhǔn)備

從屠宰場(chǎng)收集豬卵巢,，保存在含有青/鏈霉素的生理鹽水中,，運(yùn)輸溫度32~38℃，3h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,。采用抽吸法采集卵巢卵母細(xì)胞,。抽取3~6mm卵泡中的卵母細(xì)胞置于15mL離心管中，37℃水浴靜置數(shù)分鐘,，待卵母細(xì)胞沉降后,，用洗卵液洗2遍，顯微鏡下挑取顆粒細(xì)胞層達(dá)3層以上的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物(cumulusoocytecomplex,，COCs),，然后將COCs轉(zhuǎn)入U(xiǎn)型皿中培養(yǎng)42~44h，每孔加500µL成熟培養(yǎng)液,，每孔放置50~70枚,。

3.孤雌激活和胚胎培養(yǎng)

用電融合儀將成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行電激活，漂洗后,，將卵母細(xì)胞移至2mmol/L6D孵育2.5h,。分別將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到胚胎培養(yǎng)基G1、NCSU23和豬受精卵培養(yǎng)基,，24h后記錄卵裂率,。3d后，將培養(yǎng)基G1中發(fā)育的胚胎移入囊胚培養(yǎng)基G2,。再次培養(yǎng)3~4d后,，統(tǒng)計(jì)囊胚個(gè)數(shù)并收集。

4.體細(xì)胞核移植胚胎培養(yǎng)

去除成熟卵母細(xì)胞**極體,，隨后注入供體細(xì)胞,。顯微操作后，移入含10%FBS的M199培養(yǎng)基,，在38.5℃,，5%CO2條件下孵育0.5h，使用電融合儀進(jìn)行激活處理,，移入6D孵育2.5h后,，將重組胚胎在NCSU23培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，隨后替換NC-SU23繼續(xù)培養(yǎng)3~5d,，觀察胚胎的發(fā)育,。

5.體內(nèi)胚胎的收集

從人工受精的母豬體內(nèi)收集第7~8d的囊胚，所有方法參照Stokes等(2005),。每天監(jiān)測(cè)母豬的發(fā)情,，將發(fā)情日期作為0d，鑒定發(fā)情后的6,、12和18h進(jìn)行人工受精,。從子宮沖洗胚胎時(shí)使用預(yù)熱的含10%FBS的磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersa-line,，PBS)。

6.從豬胚胎分離胚胎多能干細(xì)胞

將去除透明帶的囊胚接種到絲裂霉素C(mi-tomycin-C)處理過(guò)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonicfibroblastcells,，MEFs)飼養(yǎng)層上2~4d,，囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(innercellmass，ICM)在3~5d后出現(xiàn),。待ICM大小適中時(shí),，用機(jī)械法分離細(xì)胞，重鋪到新的飼養(yǎng)層上,，并使用不同的豬胚胎干細(xì)胞(por-cineembryonicstemcells,，pESCs)培養(yǎng)基(ESM1~ESM6，表1),，胚胎多能干細(xì)胞克隆每5~7d使用機(jī)械法傳代,。

7.免疫熒光檢測(cè)

使用4%多聚甲醛固定胚胎10min，PBS洗2次后,，加入0.25%Triton-X室溫30min,，PBS洗3次，1%BSA室溫封閉1h,，4℃孵育一抗24h(1∶200,，CDX2;1∶200NANOG)。PBS沖洗3次,，孵育熒光標(biāo)記的二抗(1∶1000)室溫1h,。PBS沖洗2次后,，DAPI染色2min,，PBS沖洗2次后在熒光顯微鏡下觀察照相。液氮罐價(jià)格

8.qRT-PCR

使用0.5%鏈霉蛋白酶A去除豬胚胎的透明帶后,，立刻加入5μL的裂解緩沖液(5mmol/L二硫蘇糖醇,，1%NP-40，1U/uLRNA酶抑制劑),，冰上孵育30min,。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將裂解液反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR體系：cDNA2μL,，SYBRgreenmix12.5μL,，上下游引物各0.3µmol/L0.5μL，ddH2O補(bǔ)充到25μL,。反應(yīng)程序：95℃30s;95℃5s,，60℃30s，共40個(gè)循環(huán),。