胚胎干細胞從囊胚內細胞團分離得到，具有自我更新和分化為3個胚層和生殖細胞的潛能,。豬胚胎分離培養(yǎng)體系會改變細胞核移植胚胎,、孤雌胚胎和體內胚胎多能基因的表達，也會影響豬多能干細胞形成的效率和質量,。液氮罐

細胞培養(yǎng)：用于核移植供體的豬胎兒成纖維細胞從初生豬仔的耳部分離得到。細胞培養(yǎng)基為DMEM，15%胎牛血清,，培養(yǎng)溫度為37℃。使用0.25%（W/V）的胰蛋白酶消化,，中和后離心200×g,。將細胞重懸后并加入等量凍存液（40%DMEM，40%FBS和20%DMSO）,，貯存在液氮中,。

卵母細胞的收集和準備：從屠宰場收集豬卵巢,，保存在含有青/鏈霉素的生理鹽水中，運輸溫度32~38℃,，3h內運回實驗室,。采用抽吸法采集卵巢卵母細胞。抽取3~6mm卵泡中的卵母細胞置于15mL離心管中,，37℃水浴靜置數分鐘,，待卵母細胞沉降后，用洗卵液洗2遍,，顯微鏡下挑取顆粒細胞層達3層以上的卵丘卵母細胞復合物,，然后將COCs轉入U型皿中培養(yǎng)42~44h，每孔加500μL成熟培養(yǎng)液,，每孔放置50~70枚,。

孤雌激活和胚胎培養(yǎng)：用電融合儀將成熟的卵母細胞進行電激活，將卵母細胞移至2mmol/L6D孵育2.5h,。分別將卵母細胞轉移到胚胎培養(yǎng)基G1,、NCSU23和豬受精卵培養(yǎng)基，24h后記錄卵裂率,。3d后,，將培養(yǎng)基G1中發(fā)育的胚胎移入囊胚培養(yǎng)基G2。再次培養(yǎng)3~4d后,，統(tǒng)計囊胚個數并收集,。

體細胞核移植胚胎培養(yǎng)：去除成熟卵母細胞第一極體，隨后注入供體細胞,。顯微操作后,，移入含10%FBS的M199培養(yǎng)基，在38.5℃,，5%CO2條件下孵育0.5h,，使用電融合儀進行激活處理，移入6D孵育2.5h后,，將重組胚胎在NCSU23培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d,，隨后替換NC-SU23繼續(xù)培養(yǎng)3~5d，觀察胚胎的發(fā)育,。

體內胚胎的收集：從人工受精的母豬體內收集第7~8d的囊胚,，所有方法參照Stokes等。每天監(jiān)測母豬的發(fā),，將發(fā)日期作為0d,，鑒定后的6、12和18h進行人工受精,。從子宮沖洗胚胎時使用預熱的含10%FBS的磷酸緩沖鹽溶液,。

從豬胚胎分離胚胎多能干細胞：將去除透明帶的囊胚接種到絲裂 素C處理過的小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層上2~4d,，囊胚內細胞團在3~5d后出現。待ICM大小適中時,，用機械法分離細胞,，重鋪到新的飼養(yǎng)層上，并使用不同的豬胚胎干細胞培養(yǎng)基,，胚胎多能干細胞克隆每5~7d使用機械法傳代,。液氮罐