胚胎干細(xì)胞從囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離得到,，具有自我更新和分化為3個(gè)胚層和生殖細(xì)胞的潛能。豬胚胎分離培養(yǎng)體系會(huì)改變細(xì)胞核移植胚胎,、孤雌胚胎和體內(nèi)胚胎多能基因的表達(dá),，也會(huì)影響豬多能干細(xì)胞形成的效率和質(zhì)量,。液氮罐

細(xì)胞培養(yǎng)：用于核移植供體的豬胎兒成纖維細(xì)胞從初生豬仔的耳部分離得到。細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM,，15%胎牛血清,，培養(yǎng)溫度為37℃。使用0.25%（W/V）的胰蛋白酶消化,，中和后離心200×g,。將細(xì)胞重懸后并加入等量凍存液（40%DMEM，40%FBS和20%DMSO）,，貯存在液氮中,。

卵母細(xì)胞的收集和準(zhǔn)備：從屠宰場收集豬卵巢，保存在含有青/鏈霉素的生理鹽水中,，運(yùn)輸溫度32~38℃,，3h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。采用抽吸法采集卵巢卵母細(xì)胞,。抽取3~6mm卵泡中的卵母細(xì)胞置于15mL離心管中,，37℃水浴靜置數(shù)分鐘，待卵母細(xì)胞沉降后,，用洗卵液洗2遍,，顯微鏡下挑取顆粒細(xì)胞層達(dá)3層以上的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物，然后將COCs轉(zhuǎn)入U(xiǎn)型皿中培養(yǎng)42~44h,，每孔加500μL成熟培養(yǎng)液,，每孔放置50~70枚。

孤雌激活和胚胎培養(yǎng)：用電融合儀將成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行電激活,，將卵母細(xì)胞移至2mmol/L6D孵育2.5h,。分別將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到胚胎培養(yǎng)基G1、NCSU23和豬受精卵培養(yǎng)基,，24h后記錄卵裂率,。3d后，將培養(yǎng)基G1中發(fā)育的胚胎移入囊胚培養(yǎng)基G2,。再次培養(yǎng)3~4d后,，統(tǒng)計(jì)囊胚個(gè)數(shù)并收集,。

體細(xì)胞核移植胚胎培養(yǎng)：去除成熟卵母細(xì)胞第一極體，隨后注入供體細(xì)胞,。顯微操作后,，移入含10%FBS的M199培養(yǎng)基，在38.5℃,，5%CO2條件下孵育0.5h,，使用電融合儀進(jìn)行激活處理，移入6D孵育2.5h后,，將重組胚胎在NCSU23培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d,，隨后替換NC-SU23繼續(xù)培養(yǎng)3~5d，觀察胚胎的發(fā)育,。

體內(nèi)胚胎的收集：從人工受精的母豬體內(nèi)收集第7~8d的囊胚,，所有方法參照Stokes等。每天監(jiān)測母豬的發(fā),，將發(fā)日期作為0d,，鑒定后的6、12和18h進(jìn)行人工受精,。從子宮沖洗胚胎時(shí)使用預(yù)熱的含10%FBS的磷酸緩沖鹽溶液,。

從豬胚胎分離胚胎多能干細(xì)胞：將去除透明帶的囊胚接種到絲裂 素C處理過的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上2~4d，囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)在3~5d后出現(xiàn),。待ICM大小適中時(shí),，用機(jī)械法分離細(xì)胞，重鋪到新的飼養(yǎng)層上,，并使用不同的豬胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基,，胚胎多能干細(xì)胞克隆每5~7d使用機(jī)械法傳代。液氮罐