研究表明,，不同材料采用超低溫冷凍法脫毒時冷凍降溫方法直接關系到成苗率，選擇合適的冷凍方法對脫毒成功與否至關重要,。不同冷凍降溫方法各有優(yōu)缺點,，根據(jù)材料特性選擇適合的方法,。目前常用的冷凍方法有：快速降溫法、慢速冷凍法,、逐級冷凍法,、干燥冷凍法、玻璃化冷凍法,、包埋玻璃化法等,。直接將預培養(yǎng)材料投入液氮罐中的快速降溫法具有操作簡單、不需要特殊設備的優(yōu)點,，但是對含水量高的愈傷組織其成活率為零,，不適用該方法。
自增壓液氮罐
將材料從0℃逐漸降到-100℃,，使得其細胞中的含水量逐漸流出到細胞外,，細胞中的含水量降到最低程度，然后再從-100℃直接投入液氮中降到-196℃,，這樣可以避免水分在細胞中結冰而破壞細胞,，這種慢速冷凍法可以提高成活率,。一般細胞在-10℃時細胞外的介質基本形成結晶,，而細胞內部并未結冰，這樣形成細胞內外的蒸氣壓差,，如果使細胞在不同低溫下-20,，-50，-70,，-100℃下各處理一段時間,，使細胞內的水溶液在蒸氣壓下向細胞外不斷擴散,，脫水后細胞內原生質逐漸發(fā)生濃縮，其冰點降低,，再投入液氮中時就減弱低溫結冰對細胞造成的傷害,，大大提高回復率和成活率，這種逐級冰凍方法在多數(shù)材料超低溫保存中獲得成功,。對于含水量較高的愈傷組織,，采用將材料進行脫水預處理，然后迅速投入液氮,。這樣細胞經(jīng)過脫水處理后細胞內部含水量大大降低,，原生質的濃度大大提高，提高愈傷組織的冷凍處理后的恢復成活率,。用一種保護劑PVS2[其組成為：30%(W/V)甘油+15%(W/V)乙二醇+15%(W/V)DMSO+0.4mol/L蔗糖]對材料進行處理后再迅速投入到液氮中,，細胞經(jīng)過保護劑處理后可以避免細胞胞內外形成冰晶，而形成玻璃化狀態(tài),，這種方法成活率高,，但是很容易脫水過度，影響成活率,，采取與逐級冷凍法結合處理來提高恢復率,。當材料較多時，可以先采用褐藻酸鈣將材料進行包埋,，然后用高蔗糖濃度的培養(yǎng)基脫水預處理,，再用干燥的硅膠進行脫水處理，再迅速投入到液氮中,。為了保證成活率,，經(jīng)常結合幾種冷凍降溫方法合并使用。
自增壓液氮罐 
