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淋巴細(xì)胞的保存和活力測(cè)定

一,、分離細(xì)胞的保存

在某些情況下，分離所得細(xì)胞需要加以保存,，否則活力迅速下降,，甚至死亡,。

(一)短期保存技術(shù)

將 分離到的細(xì)胞用適量含10%～20%滅活小牛血清的Hanks、Tc-199,、RPMI1640或其他培養(yǎng)液稀釋重懸,。所用培養(yǎng)液要求等滲，具緩沖作用,， 并對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。通常置4℃保存較好,，可減低細(xì)胞代謝活動(dòng),。要注意不要迅速改變細(xì)胞所處的溫度，以免造成細(xì)胞“溫度”休克,。

(二)長(zhǎng)期冷凍保存技術(shù)

利 用液氮深低溫(-196℃)環(huán)境保存細(xì)胞,，是當(dāng)前世界上通用的細(xì)胞長(zhǎng)期保存技術(shù)。其原理在于深低溫環(huán)境可中斷細(xì)胞的代謝,，但在降溫過(guò)程由于冰晶的形成和滲 透壓的改變均可導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和部分死亡,，所以在冷凍過(guò)程中一定要加用冷凍保護(hù)劑，常用的保護(hù)劑為二甲亞砜 (dimethylsulfoxide,，DMSO),。冷凍時(shí)的降溫速度和細(xì)胞解凍時(shí)的升溫速度對(duì)細(xì)胞活力的保存有很大影響。條件合適時(shí),，凍存細(xì)胞一旦復(fù) 蘇,，恢復(fù)37℃培養(yǎng)，其形態(tài)和代謝活動(dòng)均可恢復(fù)正常,。操作的原則是先對(duì)需凍存的細(xì)胞作活細(xì)胞計(jì)數(shù),，低速離心后，取沉積細(xì)胞用含10%二甲亞砜的小牛血清配 制成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液,，分裝于凍存管內(nèi),，速即放入降溫過(guò)渡站中，避免二甲亞砜對(duì)細(xì)胞的損傷,。繼而進(jìn)行降溫冷凍,，目前常用兩步降溫法，即迅速降溫至一選擇 好的臨界溫作為過(guò)渡站,，如-80℃低溫冰箱過(guò)夜,，或在液氮罐液面以上的一層空間放置片刻，然后再放入液氮中,。如需復(fù)蘇細(xì)胞,，則需迅速解凍以恢復(fù)細(xì)胞的活 力，要求在20s以內(nèi)完全融化,。將凍存管自液氮中取出,，立即放入40℃溫水中,，融化后即從水中取出，吸出細(xì)胞懸液,，加入10倍的培養(yǎng)液中混勻,，繼而低速離 心，盡快洗去保護(hù)劑,，再懸于新培養(yǎng)液中,，計(jì)數(shù)并檢查細(xì)胞活力，然后置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),。

二,、細(xì)胞活力測(cè)定

細(xì)胞活力常用百分 比表示，活力的大小對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有很大影響,。細(xì)胞活力的測(cè)定有許多方法,，最簡(jiǎn)便常用的方法是臺(tái)盼藍(lán)(trypanblue)染色法。臺(tái)盼藍(lán)又稱錐藍(lán),，是一種 陰離子型染料,，這種染料不能透過(guò)活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色,，但死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加,，可使染料通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使死細(xì)胞著色呈 藍(lán)色,。

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