實驗原理
液氮罐
細胞凍存是細胞保存的主要方法之一,。利用凍存技術(shù)將細胞置于-196~C液氮中低溫保存,，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗,。而且適度地保存一定量的細胞,，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用,。除此之外,，還可以利用細胞凍存的形式來購買,、寄贈、交換和運送某些細胞,。 細胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護劑——終濃度5%~15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO),，可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結(jié)條件下,，細胞內(nèi)水分透出,，減少了冰晶形成，從而避免細胞損傷,。標準冷凍速度開始為-1 到 -2℃/min,，當溫度低于-25℃時可加速，到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)(-196℃),。
目前常用的保護劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油,，它們對細胞無毒性，分子量小,，溶解度大,，易穿透細胞。
實驗材料
儀器：液氮罐,、凍存管(塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶),、離心管、吸管,、離心機等
試劑：0.25%胰酶,、培養(yǎng)基、含保護劑的培養(yǎng)基(即凍存液)
附：凍存液配制：培養(yǎng)基加入甘油或DSMO,，使其終濃度達5-20%,。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。配好后4℃下保存,。
實驗步驟
1.消化細胞,，將細胞懸液收集至離心管中。
2.1000rpm離心10分鐘,，棄上清液,。
3.沉淀加含保護液的培養(yǎng)，計數(shù),，調(diào)整至5×106/ml左右,。
4.將懸液分至凍存管中，每管1ml,。
液氮罐
5.將凍存管口封嚴,。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現(xiàn)爆裂,。
6.貼上標簽,，寫明細胞種類，凍存日期,。凍存管外拴一金屬重物和一細繩,。
7.按下列順序降溫：室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→低溫冰箱(-30℃ 1小時)→氣態(tài)氮(30分鐘)→液氮。
注意：操作時應小心,，以免液氮凍傷,。液氮定期檢查，隨時補充,，絕對不能揮發(fā)干凈,，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
液氮罐 
